Amedeo Avogadro

Servizi del Laboratorio

Digestione in gel

partendo da un gel bidimensionale (o da una banda di monodimensionale) colorato in blu di Coomassie, o in Sypro Ruby, sono prelevati gli spots di interesse, tramite un sistema automatizzato per ridurre al minimo le contaminazioni da cheratina. Lo spot prelevato viene trattato con enzimi proteolitici per estrarre i peptidi che sono sottoposti ad analisi di massa.

Digestione in soluzione

digestione con tripsina di proteine in liquido. E' fondamentale che la proteina sia disciolta in un solvente volatile oppure compatibile con l'attività dell'enzima utilizzato.

Digestione robotizzata

digestione automatica con tripsina di proteine tramite un robot viene usata per progetti in cui si debbano riconoscere molte proteine, ad esempio quando si vuole creare una mappa annotata di un intero proteoma.

Analisi di peptidi o proteine in infusione

sono necessarie concentrazioni di peptidi o proteina da un minimo di 50fmol/µl e un volume minimo di circa 5µl

Purificazione tramite Zip Tip C₁₈

è indispensabile se il campione da analizzare in spettrometria di massa contiene, come spesso accade, dei contaminanti, in particolare sali.

Analisi MS/MS di peptidi

è possibile utilizzando spettrometri ibridi, con doppio analizzatore e camera di collisione o altri opportuni mezzi di frammentazione. Nel nostro caso utilizziamo un QqTOF (Q-Star) per frammentare i peptidi e ricavare lo spettro con le masse diagnostiche degli aminoacidi che li compongono. E'una tecnica indispensabile se si cerca di identificare una proteina di un organismo con genoma non sequenziato. Non di rado con la stessa tecnica si evidenziano modifiche post-traduzionali degli aminoacidi.

nanoLC-MS/MS e ricerca in banca dati

è la tecnica elettiva per identificare le proteine partendo da miscele di peptidi triptici e per quantificare campioni marcati con isotopi stabili (iCAT, iTRAQ). Il campione costituito dai peptidi triptici della proteina è caricato in piccola quantità (minimo 10fmoli) in un HPLC con flussi ridotti (200nl/min). La colonna contiene, generalmente una fase C18, che trattiene i peptidi in base alla loro idrofobicità. I peptidi eluiti sono direttamente ionizzati e inviati allo spettrometro di massa per l'analisi. I dati ottenuti possono essere confrontati con i dati presenti nelle banche dati per ottenere l'identificazione della o delle proteine presenti nel campione.