Preparazione dei campioni

PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER LA SPETTROMETRIA DI MASSA

I campioni possono essere preparati a partire da bande ottenute da gel monodimensioali o spot da gel 2D. In base alla quantità di materiale possono essere colorati con blu di Comassie, Sypro Ruby (un colorante fluorescente) o argento. Se si usa la colorazione con argento bisogna evitare l'uso della glutaraldeide nel processo di fissazione. I kit di colorazione di varie ditte sono compatibili con la spettrometria di massa. Bisogna anche tenere presente che gli spot di bidimensionale, colorati in argento o in sypro ruby e appena visibili, sono al limite inferiore di concentrazione per l'analisi di massa. E' estremamente importante ricordare che quando si preparano proteine presenti in scarsa concentrazione devono essere prese precauzioni per evitare contaminazioni di cheratina o altre fonti di contaminazione che maschererebbero i peptidi della proteina in esame. Ciò significa indossare guanti durante l'intero processo di preparazione del campione e usare apparati ben puliti per la corsa e la preparazione dei gel. Quando si tagliano le bande di proteine bisogna evitare di prelevare quantità eccessive di gel che potrebbero contenere più di una proteina e inibire le successive reazioni.

PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER IL MALDI

Raccomandazioni per la preparazione e la conservazione dei campioni!

La plasticheria usata nella preparazione dei campioni dovrebbe sempre essere lavata in una miscela di acqua e acetonitrile per togliere i possibili contaminanti presenti.

!!!!NON USARE SOSTANZE NON VOLATILI!!!!! Molte sostanze non volatili sono comunemente usate nella chimica delle proteine: glicerolo, polietilenglicole, b-mercaptoetanolo, Triton-X100, DMSO, DMF, ecc. Interferiscono con la cristallizzazione della matrice e rivestono i cristalli che si formano impedendo l'analisi al MALDI.

• I campioni cristallizzati sulla piastra sono abbastanza stabili, possono essere conservati al buio in un frigo o sotto vuoto per giorni. Si possono conservare anche per tempi molto lunghi in contenitori sigillati in atmosfera di gas inerti.


• Il campione deve essere solubile nella miscela finale con matrice/solvente. La matrice e il campione sono spesso disciolti in differenti solventi che devono rimanere in soluzione dopo che sono stati miscelati.


• Porre attenzione ai possibili cambi di composizione dei solventi durante la preparazione dei campioni dovuti alla evaporazione selettiva di solventi organici volatili dalle soluzioni acquose. Il fenomeno è molto facilitato dai piccoli volumi che in genere si utilizzano.


• Non scaldare le gocce di matrice con il campione al fine di accelerare la cristallizzazione, variare la temperatura della soluzione porta ad una alterazione nella formazione dei cristalli di matrice e all'incorporazione del campione.


• Usare soluzioni fresche di matrice. Mescolare piccoli volumi di soluzione in base alle esigenze e non usare per più di tre giorni. E' comunque meglio preparare soluzioni fresche giornalmente!


• Se c'è il sospetto che dei contaminanti sopprimano il segnale provare a purificare il campione prima dell'analisi al MALDI. Se si è già deposto il campione si può tentare di lavare i cristalli con una goccia di acqua milliQ fredda e riprovare l'analisi.


• E' buona abitudine lavare il supporto metallico del MALDI prima di usarlo per altri campioni. Per prima cosa risciacquare la piastra con lo stesso solvente in cui era disciolto l'ultimo campione per esempio acetonitrile o metanolo. Poi, lavare il target con un detergente molto diluito e uno spazzolino morbido, risciacquare abbondantemente con acqua deionizzata e lasciare asciugare completamente prima di riutilizzarlo. Per tale ragione è bene avere qualche piastra porta campione in più.


• Non lasciare cristalli non disciolti di matrice nella soluzione finale campione con matrice. I cristalli intatti, infatti, possono agire come siti di cristallizzazione che porterebbero alla formazione di cristalli molto disomogenei. Se necessario centrifugare la soluzione finale e usare solo il sovranatante.


• La soluzione di formazione dei cristalli dovrebbe essere a pH inferiore a 4, molti acidi organici usati come matrice dissociano a pH>4 ciò interferisce con la cristallizzazione. Usando una soluzione acquosa 0,1% TFA (v/v in H₂O) al posto dell'acqua si eliminano i problemi di pH.


• Contrariamente a quanto ci si può attendere ridurre la concentrazione di analita di solito porta ad un incremento del segnale nel MALDI! E' meglio quindi fare sempre delle diluizioni seriali.


• La preparazione del campione che prevede la miscelazione del campione con la matrice prima della deposizione sulla piastra di solito porta a preparazioni maggiormente riproducibili.


• La tecnica della rideposizione in acetone è spesso usata per aumentare l'omogeneità del campione. Con questa tecnica i campioni secchi sul plate MALDI vengono ridissolti in una goccia di acetone per poi lasciare che si riformino i cristalli in uno strato più omogeneo ciò aumenta la riproducibilità fra gli spot.

METODI DI DEPOSIZIONE

Abbreviazioni: alfaCHCA= acido alfa cianoidrossicinnamico, SA= acido sinapinico, DHB= acido diidrossienzoico, TFA= acido trifluoroacetico, ACN= acetonitrile, aq.=soluzione acquosa.

AlphaCHCA, SA, DHB, nitrocellulosa devono essere di grado HPLC o 'sequencing grade'.

Le soluzioni dovrebbero essere preparate al momento dell'uso. I campioni possono essere essiccati sul target MALDI in condizioni di leggera aspirazione in una campana da vuoto.

a. preparazione della matrice alfaCHCA con il metodo "Dried Droplet" 

Preparare una soluzione satura di alfaCHCA (circa 5mg/ml) in aq. 0,1% TFA/ACN 1:1 v/v il colore può essere giallo ma un acido di buona qualità risulta limpido in soluzione.

Depositare sulla piastra MALDI lo stesso volume di soluzione di matrice e di campione (circa 1µl), mescolare bene e lasciare cristallizzare.

b. Preparazione della matrice SA con il metodo "Dried Droplet"

Preparare una soluzione satura di SA (circa 5mg/ml) in aq. 0,1% TFA/ACN 1:1 v/v la soluzione è incolore.

Depositare sulla piastra MALDI lo stesso volume di soluzione di matrice e di campione (circa 1µl), mescolare bene e lasciare cristallizzare.

c.  Preparazione della matrice DHB con il metodo"Dried Droplet"

Preparare una soluzione satura di DHB in aq. 0,1% TFA/etanolo 9:1 (v/v) la soluzione è incolore.

Depositare sulla piastra MALDI lo stesso volume di soluzione di matrice e di campione (circa 1µl), mescolare bene e lasciare cristallizzare.

d. Preparazione della matrice alphaCHCA/nitrocellulosa su strato sottile.

Preparare soluzione A (incolore, limpida): nitrocellulosa 10mg/ml in acetone/isopropanolo 1:1 (v/v).

Preparare soluzione B (gialla): alphaCHCA satura in acetone.

Preparare soluzione C: mescolare A/B in rapporto 1:4 (v/v).

Depositare 1µl di soluzione C, lasciare seccare (è quasi istantaneo).

Depositare da 0,5 a 1µl della soluzione acida di peptide (TFA 0,1%) sullo spot di soluzione C. Lasciare seccare.

Lavare 1 o 2 volte con 5µl di  aq. TFA  0,1% lasciando asciugare fra i lavaggi.

e. Preparazione della matrice SA/alphaCHCA a "Sandwich".

Preparare una soluzione A (incolore, limpida): nitrocellulosa 40mg/ml in acetone.

Preparare una soluzione B (gialla): soluzione satura di alphaCHCA in acetone.

Preparare una soluzione C: mix  A/B/isopropanol 1:1:2 (v/v).

Preparare una soluzione D (incolore, limpida): SA in (aq. TFA 0,1% )/acetonitrile 1:1 (v/v).

Depositare 1µl di C, lasciare asciugare.

Depositare 1µl di soluzione acida di peptidi (TFA 0,1%), lasciare asciugare.

Depositare 1µl di D, lasciare asciugare.

Lavare una volta, se necessario, prima dell'evaporazione totale del solvente dopo l'inizio della cristallizzazione.

f. Analisi di cellule Preparazione del campione dopo fissazione e immunolocalizzazione.

Cellule  preventivamente caratterizzate con tecniche immunoistochimiche sono dissociate aggiungendo trypsina al tampone PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo dissociazione manuale le cellule marcate vengono aspirate in un fine capillare di vetro e depositate sul target . L'eccesso di PBS viene rimosso con lo stesso capillare. Dopo un breve lavaggio con 1µl di una soluzione satura di DHB in 0,1% TFA una goccia di 0,5µl della stessa matrice viene aggiunta e seccata a temperatura ambiente il campione viene immediatamente analizzato allo spettrometro di massa.

PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER L'ESI Q-TOF

I campioni che contengono peptidi da analizzare in nanoLC non devono contenere particolato di diametro superiore a 20µm in quanto i capillari dello strumento, che sono di tale diametro, si occluderebbero irrimediabilmente. Un'altra accortezza è quella di non lasciare nel campione troppo solvente organico che impedirebbe il legame con la fase solida usata in nanoLC, ovviamente se si usa una fase inversa, come ad esempio una resina C18. Le quantità di peptidi necessari in questo tipo di analisi sono generalmente inferiori rispetto al MALDI sia per la maggiore sensibilità dello strumento sia perchè i picchi dei peptidi risolti in pochi secondi entrano concentrati nello strumento. Inoltre, analizzatore Q-TOF consente di frammentare i peptidi, dando maggiori informazioni, e quindi consentendo l'identificazione anche con pochi peptidi rilevati. Il nostro strumento, attualmente, riesce a rilevare sufficienti dati per riconoscere uno standard di digerito triptico di BSA alla concentrazione di 10fmoli/µl (circa 0.6ng/µl) iniettando un solo µl nella nanoHPLC.

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References:

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