Proteomica
Spettrometria di massa in proteomica
Nel decennio scorso si è verificata una rivoluzione nell'applicazione della spettrometria di massa nell'analisi di proteine e peptidi. Ciò è dovuto in parte a due tecniche di ionizzazione che sono in grado di produrre ioni gassosi di peptidi e proteine. 'Electrospray ionization' (ESI) è la tecnica che consiste nello 'spruzzare' una soluzione liquida contenente il peptide attraverso un fine capillare tenuto ad alto potenziale. Questo processo carica le goccioline di solvente che poi rapidamente evaporano producendo ioni di peptidi, che generalmente sono condotti in un analizzatore di massa a quadrupolo o ibridi (Q-TOF).
La seconda tecnica di ionizzazione, 'matrix-assisted laser desorption ionization' (MALDI) si basa sulla co-cristallizzazione del campione con una matrice organica che assorbe la radiazione UV emessa da un laser.
Immediatamente dopo l'irradiazione, avviene un trasferimento di energia dalla matrice ai peptidi del campione, si producono così ioni gassosi che sono in genere misurati in un analizzatore di massa di tipo 'time-of-flight' (TOF).
Al fine di capire i processi cellulari è necessario identificare rapidamente i componenti del proteoma di un organismo. Con l'avanzare del sequenziamento del genoma di molti organismi modello la probabilità che una proteina del loro proteoma possa essere individuata nelle banche dati cresce esponenzialmente. Tutto questo ha rivoluzionato l'applicazione delle tecniche dispettrometria di massa nell'identificazione delle proteine nelle banche dati (spettrometria di massa applicata alla proteomica). La tecnica prevede la digestione di circa 10 femtomoli di proteina purificate su gel con una proteasi sito specifica (es. tripsina) e l'analisi dei peptidi risultanti con una accuratezza di circa 50ppm. Le masse dei peptidi ricavate possono essere analizzate con uno dei numerosi algoritmi di ricerca nelle banche dati che sono disponibili nei web sever o tramite software specifici. La maggior parte di questi algoritmi generano il profilo di masse teoriche dei peptidi, per ogni proteina presente in una banca dati, e li compara con i dati sperimentali per arrivare ad una correlazione statistica.
La ricerca può essere basata sul complesso di dati di massa derivati da un certo numero di peptidi o dalle masse derivate dai frammenti un singolo peptide derivati da un processo di frammentazione per collisione (MS/MS). Il vantaggio di ricercare nelle banche dati con dati di MS/MS è che, essendo basati sulla sequenza del peptide, saranno maggiormente 'univoci' in un'analisi di correlazione, rispetto al semplice dato della massa del peptide intero. I dati di MS/MS permettono di analizzare miscele di proteine, in quanto ogni proteina può essere individuata da un unico peptide. Inoltre, i dati di MS/MS possono essere usati per cercare nelle 'Expressed sequence Tag (EST) databases' banche dati di corte sequenze espresse che provengono da progetti di sequenziamento di tipo 'shotgun'. Molte proteine hanno solo una piccola porzione della loro sequenza rappresentata nei cloni EST e pertanto non sarebbero identificabili in base ai dati di massa di numerosi peptidi che sta alla base della tecnica PMF.